微生物的厌氧培养方法：原理、技术与应用

微生物的厌氧培养是研究严格厌氧菌和兼性厌氧菌的关键技术。这类微生物在自然界广泛分布于肠道、深海、湿地等低氧或无氧环境，参与碳循环、产甲烷、有机物降解等重要生态过程。由于氧气对严格厌氧菌具有毒性，其培养需依赖特殊技术以消除氧气并维持低氧化还原电位（Eh）。

一、厌氧培养的核心原理

1、氧气对厌氧菌的抑制机制

氧气代谢产生的超氧化物（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）等活性氧（ROS）会破坏细胞膜、酶及DNA。

严格厌氧菌缺乏超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶，无法解毒ROS。

2、氧化还原电位（Eh）的调控

厌氧菌通常需Eh低于-200 mV，需通过物理或化学手段降低环境中氧气含量并维持还原态。

二、常用厌氧培养技术

（一）物理除氧法

1、厌氧罐法（Anaerobic Jar）

将接种后的培养基放入厌氧罐。

加入产气袋（含硼氢化钠、碳酸氢钠等），注入少量水触发产气。

密封罐体，37℃培养24-48小时。

原理：利用钯催化剂催化H₂与O₂反应生成水，配合产气袋释放H₂和CO₂。

步骤：

优点：操作简便，成本低，适用于常规厌氧菌（如梭菌属）。

2、真空置换法

通过抽真空后充入无氧混合气体（如N₂:CO₂:H₂=85:10:5），重复3-4次置换罐内气体。

适用场景：实验室中需快速建立低氧环境的小规模培养。

3、Hungate滚管技术

培养基煮沸除氧后持续通入无氧气体（N₂/CO₂）。

使用预还原的厌氧试管，以注射器分装并快速密封。

通过滚管机旋转使培养基均匀凝固成薄层。

核心步骤：

应用：严格厌氧菌（如产甲烷古菌）的分离与纯培养。

（二）化学除氧法

1、焦性没食子酸法

在培养皿盖内放置焦性没食子酸粉末和碳酸氢钠（质量比1:10）。

滴加少量水后迅速密封培养皿，静置培养。

原理：焦性没食子酸（C₆H₃(OH)₃）在碱性条件下与O₂反应生成焦性没食子橙。

操作：

局限：仅适合短时培养（<24小时），氧气吸收量有限。

2、硫乙醇酸盐培养基法

培养基中添加硫乙醇酸钠（0.05%-0.1%），通过巯基（-SH）维持低Eh。

特点：适用于兼性厌氧菌（如大肠杆菌）的梯度氧培养，液体培养基中可形成氧浓度梯度。

3、刃天青指示剂法

添加刃天青（Resazurin，0.0001%），通过颜色变化（无色→粉红）实时监测氧气残留。

（三）生物除氧法

1、共培养法

将需氧菌（如枯草芽孢杆菌）与目标厌氧菌共培养，利用前者快速消耗氧气。

应用：模拟自然共生环境，研究微生物互作。

（四）专用设备法

1、厌氧工作站（Anaerobic Chamber）

预抽真空后充入混合气体，循环净化至氧含量<5 ppm。

通过空气锁传递样品，箱内完成接种、观察等操作。

结构：全封闭手套箱，内置钯催化剂、气体循环系统（N₂/H₂/CO₂）和空气锁。

操作流程：

优势：可长期维持无氧环境，适合严格厌氧菌（如拟杆菌属）的高通量实验。

三、关键操作要点与注意事项

1、培养基预处理

使用预还原灭菌培养基（PRAS），煮沸后立即冷却并充入无氧气体。

添加还原剂：半胱氨酸（0.05%）、维生素C（0.1%）或硫化钠（0.025%）。

2、快速操作与密封性

接种过程需在酒精灯火焰附近完成，减少氧气暴露。

厌氧罐或试管密封后需用凡士林或胶带加固，避免漏气。

环境验证

使用化学指示剂（刃天青、美蓝）或电子氧探头检测氧气残留。

四、应用领域

1、临床医学：分离致病性厌氧菌（如破伤风梭菌、艰难梭菌）。

2、环境科学：研究湿地、污泥中的产甲烷菌及硫酸盐还原菌。

3、工业生物技术：开发厌氧发酵工艺生产沼气、丁酸等产物。

五、总结

厌氧培养技术已从传统的焦性没食子酸法发展到智能化的厌氧工作站，但核心目标始终是模拟自然无氧生境。未来，随着微流控技术和单细胞培养的发展，厌氧菌的研究将更高效精准。实验者需根据目标微生物特性（严格厌氧/兼性厌氧）、实验规模及设备条件选择合适方法，同时注重操作规范与质量控制。

参考文献

1、Bryant, M. P. (1972). Hungate技术及其在产甲烷菌研究中的应用.

2、Sprott, G. D. (1992). 厌氧工作站的原理与操作.

3、临床微生物学手册（第12版）. 厌氧菌分离与鉴定标准流程.。