流式为什么一定要排除死细胞？

死细胞如何扰乱流式结果？

死细胞对流式结果的影响，主要来自它的两个特点：膜破了，但抗原还在；保安没了，什么染料都能乱钻。

首先，细胞死亡后，虽然膜的完整性丧失了，但表面抗原不会立刻消失。它们仍然能结合抗体，但又不像活细胞那样保持稳态。这就导致第一个问题：我们测到的阳性信号，到底来自真的阳性细胞，还是死细胞上残留的抗原？

其次是第二个问题。膜破损后，死细胞内部暴露，各种荧光染料可以自由进入，非特异性地结合到细胞内各种分子上，这可就不是膜上那一点点了。这就导致死细胞的荧光背景会异常升高，而且没有特异性——它可能在所有通道里都发出信号，因为它什么染料都可能结合一下，在散点图上常常表现为沿对角线分布的斜线信号。

这会造成几个后果：假阳性率升高、细胞分群模糊、如果存在弱阳性群体还会被淹没在高背景里。这里有个很直观的例子：外周血样本中如果不排除死细胞，CD4 和 CD8 的散点图上会出现一团诡异的共阳性细胞群，虽然可能是DP细胞，但正常情况下表达很少，肯定不能是图上这样；而死细胞排除后，正常的互斥分布就恢复了。

如何排除死细胞？

FSC/SSC光散射法

这是最简单快捷的方法。不需要染料专门标记，只要在圈门的时候稍微区分一下就可以分离大部分死细胞。原理很简单：活细胞、死细胞和细胞碎片，在光散射特性上有差异。

由于前向角散射（FSC）大致反映细胞大小，侧向角散射（SSC）反映细胞内部颗粒度。而死细胞通常会皱缩（FSC 变小）、内部结构紊乱（SSC 变大），因此在 FSC/SSC 图上，它们往往出现在活细胞群的左上方或左外侧——比活细胞小，但比碎片大，而且比活细胞混乱。

但这个方法有个局限：它区分的细胞形态上明显异常。如果细胞刚死，形态变化不明显，还没来得及皱缩等情况，光靠 FSC/SSC 不够。所以更多实验还要用死活染料进一步确认活细胞群。

死活染料法

更精确的方法是使用死活染料。原理都基于膜完整性，但有两类：

●核酸染料（如 PI、7-AAD、DAPI）：不能透过活细胞膜，只能进入死细胞结合核酸发出荧光。优点是方便，染色后直接上机，但不能洗，也不能固定，因为固定需要对所有细胞进行破膜，活细胞也会染上。

●胺活性染料：这类染料是与蛋白质伯氨基共价结合。活细胞只染上表面蛋白，荧光弱；死细胞染料进入内部，结合大量胞内蛋白，荧光强。最大的优点是染色后可固定、可破膜，适用于胞内染色实验。

哪些情况建议做死活染色？

这个问题可以理解为：样本状态会带来多少死细胞的影响，以及实验对准确度的需求有多高。

●从样本状态看：新鲜外周血、脾脏等样本，如果处理得当，死细胞比例低，单靠 FSC/SSC 通常够用。但如果是肿瘤组织、难制备的组织、冻存复苏后的细胞，死细胞和碎片会很多，必须用死活染料精确排除。

●从实验需求看：多色流式实验、弱表达抗原检测、胞内染色实验，都强烈建议做死活染色。道理很简单：颜色越多，背景越复杂；抗原越弱，越容易被死细胞的非特异性信号淹没。

反之，如果只是普通地测一下新鲜外周血的 CD3/CD4/CD8 等强表达指标，FSC/SSC 圈门通常就够了。但前提是样本状态确实好，死细胞少，活细胞健康，对实验精度没有很高的要求。

总的来说，排除死细胞是根据样本和实验精度决定如何做的必须步骤。